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烟草赤星病的生物防治研究现状及展望

来源:云南烟叶信息网

更新:2008-03-21

    烟草赤星病[Alternaria alternata (Fries)Keissler]是烟草上的一个重要真菌性病害,该病具有潜育期短、流行速度快的特点,主要在大田生长后期发生流行。赤星病在世界各烟草生产区均有发生,也是威胁我国各地烟叶生产的一个主要病害之一。赤星病于1892年首先在美国发现,1956年在北卡罗来那州突然爆发流行,造成直接经济损失2100万美元。本世纪50年代前赤星病是非洲烟草生产的重要病害,1931年在津巴布韦广泛传播。此外,哥伦比亚、阿根廷、委内瑞拉、澳大利亚、加拿大等国也陆续发生。在我国,赤星病曾在河南烟区大流行,70年代间歇危害。80年代以来,全国烟区有日益严重的趋势。据全烟烟草病虫害预测预报及综合防治站统计,2001年和2002年,烟草赤星病在全国14个省市的发病面积、产量损失、产值损失仅次于病毒病,位居第二,其中2002年赤星病发生面积达345.64万亩,产量损失1968.77万千克,产值损失17718.93万元。
            
    伴随着烟草赤星病的发生,赤星病的防治工作也在不断加强,防治方法涉及抗病育种、化学防治、生物防治、农业防治等多个领域。在众多防治方法中,生物防治对烟草生产的可持续性发展具有极大的应用前景,也是近年来科技工作者研究较多和最具发展潜力的一个领域,普遍受到国内外的关注。
           
    1 植物诱导抗性方面的研究与应用
           
    植物的诱导抗性又称系统性获得抗性(SAR,Systemic acquiredresistance),是寄主植物病原物侵染的一种主动反应,当坏死病原物侵染或某些生化制剂诱导处理后,某些植物可以对病原物的侵染产生抗性,也称为交叉保护作用、人工免疫。植物诱导抗病性和病菌激发子的研究是当今植物病理学科中十分活跃的领域,国外七十年代末开始系统试验研究,并作为防治作物病害的新学科领域和植物病害控制新对策。
           
    植物诱导抗性在烟草赤星病的生物防治中研究较深入。董汉松,王曾发等研究了烟草赤星病菌致病力分化及弱毒株抗性诱导作用、弱毒株TBA16对烟草抗赤星病诱导条件及赤星病弱毒株孢子制剂PCF1对烟草赤星病的控制作用。研究认为,用Alternaliaalternata弱毒株TBA16孢子叶面喷洒或悬滴诱导处理,均可诱导烟草对赤星病的系统抗性,用强毒株TBA28和TBA19挑战接种,抗性诱导效应分别为50%~61%和60%~71.4%,病菌毒素诱导比孢子诱导效果高35%~77%,毒素的诱导抗性最高可达100%。同时,研究认为利用烟草赤星病弱毒株诱导接种烟草植株的第12天诱导抗性最强。重复诱导可使抗性持续期延长和抗性程度提高。诱导抗性表现程度还与挑战接种的湿度、温度有关。TBA16灭活制剂PCF1大田生产试验表明,既可诱导抗性又可提高烟叶品质。
           
    文景芝等研究了分离自马铃薯的马铃薯早疫链格孢菌(Alternaliasolani)对烟草赤星病的诱导抗性,结果表明,Alternaliasolani在一定条件下可诱导烟草植株对赤星病产生系统抗性,抗性诱导效应达86%。分离自白菜、油菜、葱和丁香上的4个Alternaliaspp.菌株也可或多或少地诱导烟草植株对赤星病产生抗性。
           
    在诱导抗性的生理生化学及组织病理学方面,杨献营研究了赤星病菌(Alternariaalternata)弱毒株TBA16对诱导烟草后的生理生化学及组织病理学变化情况。研究表明,诱导处理后的叶片组织可溶性还原糖浓度下降,挑战接种后迅速上升;酚类物质的含量随抗性诱导效果的加强而增加;可溶性蛋白质除诱导后第3天增加外,其余时间均下降,同时组织内全氮增加。经电镜扫描及超薄切片观察发现,诱导处理后叶片表现孢子萌发能力降低,气孔中有电子致密物质渗出;在孢子侵入位点,细胞壁变厚,细胞质浓缩,细胞内细胞器基本没有变化。诱导处理可引起组织及细胞学变化。刘爱新等用TBA16制备激发子(elicitor,也称抗病诱导剂)诱导处理烟草后,烟草体内的几丁质酶(Cht)和β-1,3-葡聚糖(Glu)对赤星病菌的菌落生长及孢子萌发都有抑制作用,对病菌孢子有明显的攻击作用。梁元存等用TBA16制备激发子诱导烟草,研究了植物体内代谢变化情况,结果表明,烟草幼苗经激发子处理后,苯丙氨酸裂解酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性有不同程度的增加,病程相关蛋白(PRP)也有量的积累。研究也表明,经水杨酸(SA)诱导后的效应比激发子诱导的高,各种酶活性均比激发子诱导产生的大,PRP产生的量也较多。
           
    在分子水平上,梁元存研究了病菌激发子诱导烟草后,PAL基因、PRP-la基因的激活表达情况。结果表明,基因的表达产物直接参与病原物侵染的抵抗活动。
           
    诱导剂在大田生产的应用上,梁元存等研究了诱导剂对赤星病的大田控制应用,用抗病诱导剂SRS2(主要成份是病菌弱毒株TBA16的孢子壁组分)进行大田应用示范,结果表明,诱导剂SRS2能够较好地控制烟草赤星病,最高可达85%,平均防效为62.7%,比菌核净高出1.7个百分点。刘伯新等研究报道,SRS2还表现出叶片对药剂的吸附力强等药理学特性,好于菌核净,能达到有效控制赤星病,兼治其它病害,又兼顾对烟草其它性状改变(促进烟株生长和叶片扩展)的目的。
           
    2 利用拮抗作用防治研究
           
    拮抗作用的机理就是利用某些有益微生物(放线菌,真菌,细菌等)产生的抗菌物质来抑制病菌的生长,从而达到防病的目的。利用拮抗作用进行赤星病的控制应用研究较多。丁立孝等用离体烟叶平皿叠培养筛选模型筛选到了能产生对烟草赤星病菌具有很强抑菌作用的农用抗生素的链霉菌菌株S-10,并对其进行了初步鉴别及其应用研究。结果表明,从S-10菌株所产生的抗生素是碱性水溶性抗生素,抗生素发酵液在温室盆栽应用试验中,对烟草赤星病表现出了良好的防治效果。
           
    丁爱云等从烟草、番茄、辣椒根际采集到的土壤中,分离到对烟草赤星病有拮抗作用的细菌16株、放线菌10株,有较强抑制作用的细菌5株,放线菌4株,大大丰富了烟草赤星病拮抗菌资源库,同时也说明了作物根际土壤中存在大量对烟草病害有拮抗作用的微生物,烟草根际土壤中细菌最多,放线菌次之。
           
    王革等从云南省种植的主要烤烟品种的烟叶中分离出Alternariaalternata的39个株系。通过在敏感栽培品种RG17的分离叶片上人工小滴接种,这些株系的致病性成分被确定下来。根据病情指数,得到4种致病性类型。强、中、弱或无致病性的株系从不同区域、同一区域的不同小区、有时从同一片烟叶上分离出来。代表4种致病性类型的Alternariaalternata的7个株系在PDA上通过配对栽培与木霉属的18个株系。发现一个名为TV-1的具有最强抗性的株系。在光学显微镜和发射电子显微镜下检查,发现TV-1具有生长竞争、重寄生和抑制的能力。TV-1与Alternariaalternata的混合孢子的萌发试验表明,TV-1不抑制Alternariaalternata的分生孢子萌发,但抑制其萌发管的伸长。它还使新的菌丝体生长不正常、肿大、中空,最终破坏。
           
    Deborah R F从烟草叶面上分离筛选到的Bacillus cereus subsp . mycoides在试验条件下能有效地控制烟草赤星病的病情发展。Spurr的实验表明,当非病原菌A . conidia 在接种病原菌A .alternata前作为保护剂施于烟草叶片上,对赤星病有明显的控制作用。杨献营从烟草根际土壤和烟草、黄瓜、番茄、桑树的茎、叶部位分离了50株非病原牙孢杆菌和假单孢杆菌,在培养条件下对烟草赤星病菌进行了生物拮抗作用测定。结果表明,非病原细菌对烟草赤星病菌有较强的拮抗作用。在不同来源的非病原细菌中,以来自烟草根际的非病原细菌对烟草赤星病菌的拮抗作用最强,拮抗菌通过产生细菌素而抑制目标菌的扩展。选取拮抗性较强的拮抗菌,在温室条件下处理(喷洒)烟苗,结果对烟草赤星病具有较强的抑制作用。
           
    马冠华为利用有益微生物防治烟草某些病害,从7个烤烟品种(云烟85、红大、K326、K346、RG11、G28和NC89)不同生育期的根、茎、叶中分离获得内生细菌1729株,并通过平板对峙培养法筛选出对赤星病菌有较好拮抗活性的菌株61、38、52和55株。结果显示,在各个品种、各个时期及根、茎、叶中均有不同数量拮抗这4种病原菌菌株存在。
           
    李梅云等采用对峙培养,研究了18个木霉菌株对链格孢菌拮抗作用,所有木霉菌均不同程度地抑制供试病原菌的生长;由于木霉菌有较强的营养竞争能力,大多数木霉菌株占据平皿的比例远高于病原菌所占比例;这些说明木霉菌对链格孢菌的拮抗作用主要表现为竞争、抗生。其中以TR13拮抗作用最好,拮抗系数为2,也是拮抗系数最小的菌株之一。结果表明,TR13在防治烟草赤星病菌病害方面有一定的利用潜力,可以作为烟草赤星病生防菌的出发菌株。
           
    方敦煌等从烟草赤星病斑上分离到14株拮抗赤星病菌的微生物,对峙培养发现其中6株对赤星病菌具有不同致病力的6个菌株具有拮抗作用,室内离体叶片悬滴法测定AM1、AM2、AM6三株100倍带菌培养液对赤星病的防效达100%,平皿测定AM6100倍带菌培养液对强致病力病菌的抑制率为100%,其灭菌滤液的抑制效果为81.8%。抑菌机理主要是产生拮抗物质。
           
    在拮抗菌的应用研究上,王革等将由TV-1制成的杀生物剂应用到试验室中新鲜分离的叶片、幼苗和大田烟株上,确定其控制效果。试验室中的结果表明,杀生物剂在105孢子/ml浓度下能抑制叶片斑点的扩大,在107孢子/ml下能有效地防止病斑生长。大田试验证明,在植烟土壤中应用杀生物剂,能促进烟苗生长。当TV-1与营养土的比例为1:15时,TV-1应用对幼苗生长有显著效果。与对照相比,幼苗枯萎控制效果为86.5。当早期以465kg/hm2和930kg/hm2用于土中、后期以104孢子/ml喷于叶片上时,对大田烟草赤星病的控制效果分别为60.57和70.53。王绍坤等研究了0.3%科生霉素200倍液,经田间试验防效为80.2%,1.5%的多抗霉素150倍液,防效为74%,科生霉素防效高且成本低,是防治赤星病的理想药剂。储慧清,方敦煌等进行了球孢链霉菌AM6代谢拮抗物质防治烟草赤星病试验。采用不同的施用浓度、不同的施用次数在自然发病条件下进行田间小区防效试验。结果表明,含有AM6拮抗物质的制剂喷雾烟草叶片对烟草赤星病有较好防治效果。其防效随制剂中拮抗物质含量的增加而提高,以100倍液施用2次防效较好,田间防效为80.3%。含有AM6拮抗物质的制剂对烟草无明显药害。
           
    3  转基因技术防治赤星病
           
    吴中心等以烟草赤星病的抗性材料净叶黄DNA为供体,感病材料NC89为受体,通过涂抹柱头法和注射子房法,通过外源DNA的导入处理,获得了一个抗赤星病性状可稳定遗传的株系。
           
    Liu guo-sheng利用从病原细菌Pseudomonas sytingaePv.tomato中获得的无毒基因avrD片段与病原菌诱导型的特异启动子PⅠⅡ、CHS和PAL构建成表达盒,通过土壤农杆菌分别转化烟草品种K326和BottomSpecial。经烟草赤星病菌孢子定量接种转基因植株及其离体叶片,筛选到一批高抗植株。Southern分子杂交检测证明,启动子-avrD嵌合基因已整合到寄主染色体并获得表达。
           
    窦道龙利用NDR1(nonrace-specific diseaseresistance)基因在植物系统获得性抗性的信号传导途径中起着重要的作用,过量表达该基因的拟南芥对不同病原菌的抗性都有提高。通过PCR技术首次克隆了拟南芥Wassilewskija生态型的NDR1基因,与Columbia生态型相比,该基因共有7处碱基不同,引起编码氨基酸变化4处。构建了植物高效表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草,经PCR和Southern鉴定,外源基因已整合到植物基因组中。随机挑选10个转基因株系进行抗病性分析,其中3个株系对赤星病的抗性明显增强。
           
    时焦等首次报道将来源于Baculovirus的几丁质酶基因导入烟草,所获转基因烟草对烟草赤星病有一定抗性。方玉达[39,40]通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导,将水稻几丁质酶基因导入烟草(Nicotianatabacum)栽培品种中,并得到转基因植株。导入的3个基因即nptⅡ、bar和几丁质酶基因在子一代以近3:1的比例分离。表达水稻几丁质酶的子一代转基因烟草表现出对烟草赤星病病原真菌(A.alternata)的抗性。
           
    蓝海燕等利用烟草碱性β-1,3-葡聚糖酶及菜豆碱性几丁质酶基因构建了组成型表达的双价植物表达载体pBLGC,利用农杆菌介导法转化了烟草,并得到了转基因植株。对其进行分子生物学分析的结果表明,部分转基因植株在所有检测中都显示较强的阳性反应,这说明外源基因已整合到烟草基因组中并得到正确表达,活体接菌实验初步表明,转基因植株与对照相比,对赤星病的侵染具有较强的抵抗能力。
           
    蒋冬花等用 PCR法从隐地疫霉(Phytophthoracryptogea)基因组DNA中克隆了cryptogein(Cry)基因。将Cry基因的13位赖氨酸(K)突变成缬氨酸(V),获突变基因CryK13V,并将其构建于CaMV35S启动子控制的植物表达载体上。通过农杆菌介导的叶盘转化法转入烟草,经卡那霉素抗性筛选获33株再生植株,PCR检测和Southern杂交分析表明CryK13V基因已整合到烟草基因组中。接种试验结果表明,转基因烟草植株对赤星病菌抗性有提高。Northern杂交分析表明,微弱的CryK13V基因在转化植株中的表达就足以激活PR1和OPBP1等防卫反应相关基因的表达,而且表达丰度与转基因植株的抗病性有着一定的正相关性。
           
    4 研究展望
           
    生物防治作为植物病害综合防治的重要组成部分,具有无污染、无公害、长效性等优点,也是控制烟草赤星病的经济、有效、持续的途径。国内烟草赤星病的生物防治起步较晚,要充分利用生物资源进行赤星病的控制,还有很多工作要做。
           
    4.1 

    在诱导抗性方面,抗病激活剂是一个比较有前途的研究方向,它代表着一种全新的植保技术和概念,改变了以往几乎所有杀菌剂都遵循的直接杀菌原则,通过激活植物自身对病害免疫力达到抗病目的。目前的抗病激活剂主要是烯丙异噻唑(probenazole,PBZ)、活化酯(acibenzolar,BTH)、本甲酸、N-氰甲基-2-氯异菸酰胺(NCI)、2,6-二氯异菸酸(INA),利用抗病激活剂防治植物病害的例子有:烯丙异噻唑有防治水稻白叶枯病等细菌性病害,活化酯防治麦类白粉病。但是,目前抗病激活剂在烟草赤星病的防治上报道较少。VA菌根菌(VAM)也能诱导植物抗性,防治植物病害的基本原理:一是引起植物体内的生理变化产生抗性;二是引起植物体的形态变化,从而产生抗侵入、抗感染的抗性;三是VAM感染植物根部后可通过改变根系分泌物的成分而影响根际微生物群落的组成,阻止病原菌在根部的定居,研究表明,VAM可防治柑桔根腐病、小麦立枯病、番茄立枯病、番茄萎缩病、由油壶菌(Olpidium)引起的烟草枯萎病、洋葱根腐病。汪开治报道,利用泡囊丛枝状菌根真菌和木炭堆肥可防治丝核菌或腐霉在黄瓜上引起的猝倒(立枯)病、黄瓜与草霉的镰孢萎蔫病,以及番茄的细菌性萎蔫病。VAM对烟草赤星病的防治研究也未见报道。这些能诱导植物产生抗性的物质值得在烟草赤星病的防治上进行试探。另外,激素、辐射等都有可能诱导植物产抗病性。筛选建立烟草赤星病的抗性诱导因子谱,从中选择诱导抗性效果好,容易批量生产的因子,是生物防治研究的一个重要内容。
           
    4.2  

    植物源杀菌剂的研究与利用也是生物防治的一个重要组成部分。植物源杀菌剂是利用天然植物资源开发的杀菌剂,具有无公害、无污染、无药害、无残毒、药效期长、不易产生抗药性、对光温性能稳定、在空气和土地中不易分解等特性。M.M.Shenol选用了45种植物的提取物。叶片提取采用Gupta等人描述的方法,植物提取物抑制真菌径向生长的实验采用Grover及Moore的方法。培养基为马铃薯葡萄糖琼脂与植物提取物的混合物,混合比为1∶1及10∶1。试验结果表明:16种植物提取物没有抗菌特性,而其余29种植物在1∶1浓度下,有显著的抑制烟草赤星病菌径向生长的作用,抑制作用在10~100,抑制作用为100的四种植物为:Lawsoniaintermis、Leucas aspera、Ocimun sanctam和Thevetiaperuviana。如果培养基浓度稀释为10∶1,则只有Thevetiaperuviana抑制率为100。吴林曾研究过植物防病剂巴姆兰喷施大田烟株,300倍液防治烟草赤星病效果显著。实际上,据昆明植物研究所研究表明,能产生抗菌物质的植物数千种。因此,充分利用植物资源进行烟草赤星病的防治具有十分广阔的前景,对保证烟草的持续稳定发展必将起到至关重要的作用。
           
    4.3  

    叶面微生物群体及内生真菌群体的研究。烟草植株表面和体内也生存着多种微生物,和烟草保持共生的关系。病原物侵染烟草后,必然要和这些菌类发生关系。对这一现象进行深入研究,对筛选烟草赤星病菌的拮抗菌,也是一个重要途径。
           
    烟草赤星病作为烟草生产上的重要病害,相信随着持久深入的研究,生物防治必将大大发挥其应有的作用,成为赤星病综合防治中重要的组成部分。

编辑:江澜


 
 


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